正式毒性实验是指最终确定被试化学物质毒性浓度的急性毒性实验。在预备实验的基础上，以几何级数配置试验溶液浓度，并设空白对照。将一定数量的实验生物放置于配置好的试验溶液中，观察记录24、48、72和96h实验生物的死亡数，再用统计学方法求出各时间间隔内的半数致死浓度。实验方法有流水式、净水式或换液式。实验容器大小及实验生物数视情况而定。如用鱼苗为实验材料，一般每组放10尾，试验溶液体积按1L水1g鱼的比例安排。需设平行实验。实验期间不喂食，试验溶液溶解氧充足，不低于饱和值的70%。水温、pH值、硬度保持稳定，并符合一定要求。